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Einige Bemerkungen zu Paläo-DNA

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  • Einige Bemerkungen zu Paläo-DNA

    Das Thema „Paläo-DNA“ ist recht populär und wurde auch schon in vielen Romanen und Filmen aufgegriffen. Das Klonen von Dinosauriern oder Mammuts ist natürlich ein spektakuläres Thema, mit dem man viel Aufmerksamkeit erlangen kann. Aber auch auf einer weniger hoch gehängten Ebene ließen sich aus alten DNA-Stücken interessante Informationen gewinnen. Allerdings habe ich oft den Eindruck – auch bei den Diskussionen hier im Forum – dass vielen nicht so ganz klar ist, wie man DNA aus fossilem oder subfossilem Material gewinnt, welche Methode dafür verwendet wird und welches die Möglichkeiten und Grenzen der Thematik sind. Sofern Interesse besteht, würde ich gerne einen kurzen Überblick über die aus meiner Sicht interessantesten Punkte des Gebietes geben, die da wären:

    A) Die Methode der Genisolierung via PCR, ihre Möglichkeiten und Fallgruben,

    B) Einige interessante Fälle von Dinosaurier-DNA,

    C) DNA aus Insekten, die in Bernstein eingeschlossen erhalten geblieben sind,

    D) Genomprojekte für einige interessante Spezies der Eiszeit,

    E) Berichte über Bakterien, die nach mehreren Millionen bis zu einer Viertelmilliarde Jahren Einschluss in Salzkristallen oder in Bernstein wiederbelebt wurden,

    F) Berichte über die Isolierung ganzer Genome alter Lebensgemeinschaften (Bakterien).

    Was ich persönlich dabei am interessantesten finde ist die Frage, wie authentisch solche Ergebnisse sind oder anders ausgedrückt, wie wahrscheinlich es ist, tatsächlich alte genetische Information aus einer längst vergangenen Epoche in den Händen zu halten.

    Ich würde die Beiträge in lockerer Folge hier einfügen. Falls es niemanden interessiert, so könnt ihr das natürlich auch kundtun.

    Ich habe mir mal erlaubt, hierfür ein eigenes Thema zu eröffnen, weil ich die Diskussion gerne vom Thema der Auferstehung von Arten trennen möchte.


    A) Die Polymerasekettenreaktion und ihr Potenzial

    Alles steht und fällt mit der Methode der Polymerasekettenreaktion (PCR). Dieses Verfahren ermöglicht die Vervielfältigung ausgewählter DNA-Moleküle in drei Schritten. Hierfür werden folgende Komponenten benötigt:

    - Ein Enzym zum Vervielfältigen der DNA (die Polymerase),
    - ein dafür geeigneter Puffer,
    - kurze DNA-Moleküle zum Starten des Experimentes („Primer“),
    - die einzelnen Nukleotidbausteine der DNA als separate Moleküle und
    - die eigentlich interessante DNA, die man vervielfältigen möchte.
    Alles zusammen liegt in wässriger Lösung vor.

    Die Prozedur ist nun wie folgt:

    Alle Komponenten werden in kleinen Reaktionsgefäßen gemischt.

    1) Die als Doppelstrang vorliegende DNA wird zunächst bei 95°C thermisch in Einzelstränge aufgetrennt („geschmolzen“).

    2) Nach Abkühlung auf eine gut gewählte Temperatur (meist zwischen 40 und 68°C) lässt man spezielle Startermoleküle („Primer“) an genau definierte Abschnitte anbinden. Diese Bindung erfolgt sequenzspezifisch über die in der DNA vorliegenden Basen. Dabei bindet immer ein Adenin an eine Thymidinbase und Guanin bindet an Cytosin. Durch die in den Primermolekülen vorliegende DNA-Sequenz lässt sich somit der zu vervielfältigende Abschnitt ganz genau eingrenzen:

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Name: dsDNA.jpg
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ID: 4291205
    Quelle: Untitled Document

    3) Nach einer weiteren Temperaturerhöhung auf üblicherweise 72°C gibt man der DNA-Polymerase die Gelegenheit, ausgehend von den gebundenen Primern den DNA-Strang zu kopieren. Das Enzym benötigt einen kurzen Abschnitt doppelsträngiger DNA, um mit seiner Aktivität beginnen zu können. Diesem Zweck dienen die Primer, die somit maßgeblich entscheidend für die Spezifität der Reaktion sind. Die Vervollständigung des Doppelstranges erfolgt nur in einer Richtung.

    Anschließend kehrt man zurück zu Schritt 1) und wiederholt die Prozedur zyklisch (üblicherweise 25-35 mal). In jedem Schritt entstehen aus ursprünglich einem Doppelstrang DNA zwei Doppelstränge. Das Grundprinzip ist in den nächsten beiden Abbildungen ganz gut verdeutlicht:


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Name: PCR.png
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Größe: 275,2 KB
ID: 4291199
    Quelle: https://www.abiweb.de/assets/courses...-bio-1/PCR.png


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Name: a30795.000-1_big.gif
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Größe: 7,8 KB
ID: 4291200
    Quelle: http://www.tk.de/rochelexikon/pics/a30795.000-1_big.gif


    Die Reaktion verläuft zunächst exponentiell, wird sich mit fortschreitendem Verbrauch der Ausgangssubstanzen allerdings abflachen:


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Name: habil-figure-2.jpg
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ID: 4291201
    Quelle: http://www.gene-quantification.de/habil-figure-2.jpg



    Nach Abschluss der Reaktion kann man einen Teil des Reaktionsansatzes im elektrischen Feld auf einem Agarosegel nach Molekulargewicht auftrennen und die Position der DNA-Moleküle mit fluoreszierenden Farbstoffen sichtbar machen. Das sähe unter optimalen Bedingungen so aus wie auf dem nachfolgenden Bild:


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Name: 2191-0855-1-32-1.jpg
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ID: 4291203
    Quelle: www.amb-express.com - Figure


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Name: GelElectrophoresisFigure.jpg
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ID: 4291204
    Quelle: https://www.mtholyoke.edu/courses/cw...esisFigure.jpg


    Beide Bilder sind so orientiert, dass am oberen Rand die Geltaschen zu sehen sind, in welche die DNA-Lösung eingefüllt wird. Im elektrischen Feld bewegen sich die kleineren Moleküle weiter als die großen. Links ist der Standard für das Molekulargewicht aufgetragen (größte Moleküle oben, kleinste Moleküle unten).

    Nun hat man die Ziel-DNA in ausreichender Menge vorliegen, um damit weiterarbeiten zu können. Die Ausbeute eines einzelnen 50 Mikroliter-Reaktionsansatzes liegt üblicherweise im dreistelligen Nanogrammbereich, in günstigen Fällen kann man auch 1 Mikrogramm und mehr DNA erhalten. Anschließende Verfahrensschritte wären z.B. die Überführung der gewonnenen DNA in ein Plasmid und/oder eine DNA-Sequenzierung.


    Konservierte und variable Genbereiche

    Ausgangspunkt der PCR ist immer ein Stück DNA, dessen Sequenz man kennt, denn für dieses muss man die zur Vervielfältigung notwendigen Primer erstellen. Das Kopieren vollständig unbekannter Sequenzen ist nicht möglich. Glücklicherweise existieren bereits Datenbanken für die Genome ganz verschiedener Organismen, so dass man sich immer irgendwelche Ausgangssequenzen suchen kann. Dabei kann man ausnutzen, dass die einzelnen Abschnitte eines Gens im Organismus einem unterschiedlichen Konservierungsdruck ausgesetzt sind. Gensequenzen für strukturell oder funktionell wichtige Proteinteile werden im Laufe der Evolution seltener verändert als andere, denn entsprechende Mutanten könnten sich nicht so gut fortpflanzen oder würden gleich sterben. So kann man sich z.B. anschauen, welche Teile von Elefantengenen besonders stark konserviert geblieben sind und mit diesem Ansatz versuchen, entsprechende Genbereiche aus Überresten von Mammuts zu gewinnen.

    Ein Beispiel ist hier mal anhand des Clusters für die Gene der Ribosomen und ihre Untereinheiten dargestellt:

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Name: primer5.gif
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ID: 4291206

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Name: primer2.gif
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ID: 4291207
    Beide aus: Conserved primer sequences for PCR amplification and sequencing from nuclear ribosomal RNA

    Hierbei stellen die Pfeile die Bindungsstellen der Primer dar. Die DNA wird von diesen Primern ausgehend in Pfeilrichtung amplifiziert.

    Unter günstigen Umständen kann man mit handelsüblichen Polymerasen DNA-Stücke bis zu einer Länge von ca. 3.000 Basen bzw. Basenpaaren (bp) gewinnen. Speziell optimierte Polymerasen können laut Herstellerangaben auch Abschnitte bis zu 40 Kbp (40.000 Basenpaaren) vervielfältigen, weil sie länger mit dem Strang verbunden bleiben und nicht so schnell wieder abdriften (sogenannte „Long-Distance-PCR“). Allerdings ist hier die Ausfallquote auch höher, das heißt, es klappt meist nicht so schön, wie es im Katalog suggeriert wird. Es ist mir zumindest noch nie gelungen, ein 40 Kbp-Fragment in einem einzigen Durchlauf zu gewinnen. Das ist in der Regel aber auch gar nicht notwendig, weil es auch für die nachfolgenden Anwendungen oft günstiger ist, sich die DNA in kleinere Einheiten zu zerlegen.

    Um das komplette Genom eines Organismus sequenzieren zu können, sind ganz viele einzelne PCR-Ansätze erforderlich. In jedem Ansatz wird nur ein kleiner Teil eines Gens vervielfältigt und die dabei gewonnene Sequenzinformation verwendet man zur Herstellung der Primer für den nächsten Abschnitt. Schon die Darstellung einzelner Chromosomen des Menschen hat ursprünglich Jahre gedauert (pro Chromosom).


    Selektivität des Prozesses (!)

    Als exponentiell verlaufende Reaktion unterliegt die PCR Selektionseffekten, die sich auf ganz verschiedene Art und Weise auswirken können. Einmal angenommen, in einer DNA-Lösung liegen zwei gleich lange Abschnitte für dasselbe Gen vor, die aus unterschiedlichen Organismen stammen (nennen wir sie Sequenz A und B). An die Enden beider Sequenzen binden dieselben allgemeinen DNA-Primer. Sequenz A weist jedoch einen etwas höheren Guanin/Cytosin-Gehalt auf als Sequenz B und bildet deswegen etwas ungünstige Sekundärstrukturen aus, die schwieriger aufzuschmelzen sind. In einer gemeinsamen Reaktion wird unter gemittelten Bedingungen Sequenz B gegenüber Sequenz A bevorzugt vervielfältigt, weil diese Sequenz für die Polymerase einfacher zugänglich ist. Schon nach wenigen Zyklen werden die Kopien von Sequenz B den Pool dominieren und es wird nachfolgend immer mehr von Sequenz B produziert. Schaut man sich am Ende das Ergebnis an, so wird man fast ausschließlich Kopien von Sequenz B vorfinden, während Sequenz A vollkommen unterrepräsentiert bleibt. Und dies, obwohl beide Sequenzen in gleichen Mengen in die Reaktion eingesetzt wurden.

    In sehr extremen Fällen kann es vorkommen, dass eine nur in winzigen Spuren in der Probe vorliegende Sequenz gegenüber der eigentlich anvisierten Ziel-DNA ausschließlich amplifiziert wird. Dies tritt besonders häufig auf, wenn man mehr oder weniger undefinierte Mischungen von irgendetwas untersuchen möchte, wie z.B. Bodenproben oder alles, was mal aus irgendeinem Erdreich isoliert wurde. Ein besonders anfälliges Beispiel sind auch dem Freiland isolierte Kulturen von Mikroorganismen, z.B. Pilze. Kann man die Spezies nicht anhand morphologischer Kriterien zuordnen und setzt die PCR zur Artbestimmung ein, so kann man durch das Ergebnis böse auf’s Glatteis geführt werden, wenn z.B. die vorliegende Kultur doch nicht so rein ist, wie man annimmt und im Hintergrund noch ein anderer Organismus wächst, den man nicht gesehen hat.


    Sensitivität

    Die Methode ist außerordentlich sensitiv. Rein prinzipiell ließe sich damit sogar ein einzelnes DNA-Molekül vervielfältigen und analytisch verwertbar machen. Praktisch liegt die Grenze meist etwas höher und Ansätze zur quantitativen Bestimmung der Ausgangs-DNA kommen schon mit weniger als 20 Ausgangsmolekülen in Schwierigkeiten.

    In der Sensitivität liegt einerseits die Stärke der Methode, sie ist andererseits aber auch die Quelle einer ganzen Vielzahl von Problemen. Hier nur eine Auswahl:

    a) Die Bindung der Primermoleküle ist sequenz-, temperatur- und salzabhängig. Bei wenig strengen Reaktionsbedingungen können die Primer auch an DNA-Abschnitte binden, die ihrer Komplementärsequenz lediglich ähnlich sind. Als Ergebnis würde man einen vollständig anderen, ungewollten DNA-Abschnitt kopieren.

    b) Auch die DNA-Polymerase kann durch ungünstige Umstände – z.B. DNA-Präparationen, in denen noch Rückstände anderer Substanzen enthalten sind – zu unspezifischem Amplifikationsverhalten gebracht werden.

    c) DNA ist allgegenwärtig. Jedes vielzellige Lebewesen gibt mit den abgestorbenen Zellen z.B. der Haut oder der Blätter auch DNA an die Umgebung ab. In je mehr Kopien ein DNA-Molekül in der Zelle vorliegt, desto häufiger befindet es sich auch in der Umgebung. Dies ist bei der Präparation der Ausgangs-DNA zu beachten – d.h., sehr sauberes Arbeiten ist unabdingbar.

    d) Das allerbeste Substrat für eine PCR ist ein DNA-Molekül, welches bereits durch diese Methode generiert wurde, denn es erfüllt alle thermodynamischen Kriterien für eine effiziente Amplifikation.

    Ganz besonders aus Punkt d) ergeben sich eine Vielzahl praktischer Probleme, die bei der Organisation des Labors zu beachten sind. Sofern möglich, sollte man die DNA-Extraktion, die eigentliche Zusammenstellung der PCR-Reaktion und den Umgang mit den Amplifikationsprodukten räumlich voneinander trennen und für jeden Teilschritt auch eigenes Arbeitsmaterial anschaffen, welches tunlichst nicht zwischen den einzelnen Räumen ausgetauscht wird. Eines der größten Probleme bieten die zur Dosierung verwendeten Mikroliterpipetten. Diese werden mit Einwegspitzen versehen, welche nur für den einmaligen Gebrach gedacht sind (Flüssigkeit aufnehmen, diese im neuen Gefäß ablassen, Spitze abwerfen und für den nächsten Schritt wieder eine neue Spitze aufnehmen). Am Ausgang der Pipettenspitze entstehen zwangsläufig Mikroaerosole. Ein besonders anschauliches Foto davon ist dieses hier:


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Name: Aerosol.JPG
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Größe: 30,2 KB
ID: 4291202
    Quelle: Bioaerosols


    Diese Aerosole entstehen auch dann, wenn man sie mit bloßem Auge nicht sieht und der Meinung ist, sauber gearbeitet zu haben. Mit Aerosolen werden jedoch Substanzen, insbesondere DNA, verschleppt. Die nachfolgend verlinkte Seite enthält eine Abbildung, welche die Verteilung von Aerosolen innerhalb der Pipette ganz anschaulich darstellt:

    ep Dual Filter TIPS - Infiniti Bioanalitika Solusindo

    Aus der obigen Abbildung ergibt sich auch gleich eine Lösung, nämlich die Verwendung von Spitzen, die mit einem internen Filter versehen sind. Allerdings sind die gestopften Spitzen erheblich teurer als die ungestopften, so dass an diesem Punkt gerne mal gespart wird. Auch löst man damit nicht das Problem der Aerosolbildung am Ausgang der Spitze.

    In vielen Laboren werden die ungiftigen Abfälle der täglichen Arbeiten – Pipettenspitzen, Reaktionsgefäße, etc. – gesammelt und nach der Sterilisation in einem Autoklaven (bei 1,2 bar und 121°C) in den Hausmüll gegeben. Für die Arbeit mit Bakterien und anderen Mikroorganismen macht dies Sinn und ist sogar gesetzlich vorgeschrieben. Allerdings werden in vielen Laboren sowohl der Einfachheit halber und auch um rechtlich auf der sicheren Seite zu sein einfach alle anfallenden Abfälle autoklaviert. Für PCR-Produkte ist dies jedoch eine ganz außerordentlich schlechte Idee. Einerseits zerstört die Hitze das DNA-Molekül nicht, sondern es wird lediglich aufgeschmolzen – die Stränge trennen sich – und es fügt sich bei der Abkühlung ganz ordentlich wieder zusammen. Sehr viel schlimmer wiegt jedoch, dass der im Autoklaven vorherrschende Dampf ein Aerosol erzeugt, in welchem auch DNA-Moleküle mitgenommen werden. Öffnet man nach der Sterilisation den Autoklaven, so entweicht das Aerosol in den Raum und überzieht alles – Wände, Regale, Geräte, Biologen, … - mit einem feinen Film, in welchem sich die gesammelten PCR-Amplifikationsprodukte der eigenen Arbeiten befinden. Es ist nahezu unmöglich, den Raum wieder so weit zu reinigen, dass die PCR-Reste wieder verschwunden sind.


    Verifikation der Ergebnisse

    Das schlimmste, was einem mit der PCR passieren kann und was zwangsläufig auch ziemlich häufig auftritt, ist ein falsch positives Ergebnis – also eine Sequenz oder ein Reaktionssignal, welches aussieht wie das gesuchte, jedoch etwas ganz anderes ist. Daraus ergibt sich die Notwendigkeit, das eigene Ergebnis in einer geeigneten Art und Weise verifizieren zu müssen. Hierfür seien als Möglichkeiten mal genannt:

    a) Sequenzierung des erhaltenen DNA-Abschnittes und Abgleich mit den Datenbanken. Untersucht man z.B. Pilze, die mit Pflanzen in Symbiose leben und man erhält im PCR-Experiment Sequenzen von Arten, die bislang eher als Schimmelpilze und Lebensmittelzersetzer in Erscheinung getreten sind, so ist dies bereits ein Hinweis auf ein falsch positives Signal.

    b) Vegleich der DNA-Sequenz mit anderen in einem phylogenetischen Stammbaum. Gruppiert sich die eigene Sequenz mit den homologen Sequenzen bekannter verwandter Arten? Falls nicht, aufpassen.

    c) In problematischen Fällen Austausch aller verwendeten Chemikalien, Neupräparation der Proben-DNA und Wiederholung des Experimentes.

    d) Verwendung von Kontrollansätzen mit anderen Primerkombinationen, welche einen Teil der gesuchten und im ersten Durchgang erhaltenen Sequenz ebenfalls amplifizieren sollten.

    e) Bei Bedarf Wiederholung aller Schritte in einem anderen Labor.

    f) Sofern möglich, Rückhybridisierung des DNA-Abschnittes aus der PCR auf die genomische DNA des Ausgangsorganismus. Weil bei diesem Schritt keine Vervielfältigung im Spiel ist, kann man somit auf sehr elegante Weise zeigen, dass die PCR-Sequenz tatsächlich aus dem Genom des untersuchten Organismus stammt. Je nach natürlicher Kopienzahl und verwendeter Detektionsmethode benötigt man für diesen Test allerdings mindestens einige Mikrogramm oder Milligramm DNA. Die Rückhybridisierung bietet sich somit an in Fällen, wo man es mit lebenden Organismen zu tun hat und auf unkomplizierte Weise mehr DNA extrahieren kann: Blätter von Pflanzen abschneiden, Zellen in Flüssigmedium anzüchten, etc. Für Paläo-DNA ist dieser Test aufgrund der geringen Mengen an Ausgangs-DNA in den allermeisten Fällen nicht anwendbar.

    Dies als allgemeine Vorbemerkungen zur Methode. Wer sich damit näher befassen möchte dem sei eines der Polymerase-Handbücher von Qiagen ans Herz gelegt. Die sind ganz gut und verständlich geschrieben:

    https://www.qiagen.com/de/resources/...868aa7&lang=en

    Sofern Interesse besteht, wäre der nächste Punkt einige berichtete Fälle von Dinosaurier-DNA und die daraus entstandenen Diskussionen und Bewertungen.
    Zuletzt geändert von Liopleurodon; 07.06.2015, 16:20.
    "En trollmand! Den har en trollmand!"

  • #2
    Wow, das ist doch mal ein schöner Threadauftakt und Beitrag.
    Vielen Dank!

    Und jetzt muss ich mir den mal in Ruhe durchlesen.
    .

    Kommentar


    • #3
      Vielen Dank

      Das ist ein Grund, warum Off Topic T&W ein besonderes Aushängeschild des SFF ist!
      \\// Dup dor a´az Mubster
      TWR www.labrador-lord.de
      United Federation of Featherless
      SFF The 6th Year - to be continued

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      • #4
        Interessanter Thread. Habe den ersten Post jetzt mal überflogen. Es gibt nämlich einen Punkt an dem ich immer mal wieder geistig hängen bleibe:
        Unterscheidung von Mitochondrialer DNS und ZellkernDNS.
        Diesbezüglich möchte ich mich natürlich auch weiterbilden.

        Besonders interessant ist die Sache mit der "Auflösung" von DNA-Molekülen.

        Kommentar


        • #5
          Zitat von Sternenkreuzer Beitrag anzeigen
          Interessanter Thread. Habe den ersten Post jetzt mal überflogen. Es gibt nämlich einen Punkt an dem ich immer mal wieder geistig hängen bleibe:
          Unterscheidung von Mitochondrialer DNS und ZellkernDNS.
          Diesbezüglich möchte ich mich natürlich auch weiterbilden.

          Besonders interessant ist die Sache mit der "Auflösung" von DNA-Molekülen.
          Was genau ist dir denn zwischen nuklearer und mitochondrialer DNA unklar?

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          • #6
            Im Eingangspost wird ja immer wieder beschrieben wie DNA wieder hergestellt werden kann etc. Das bezieht sich dann vermutlich sowohl auf Zellkern-DNA als auch auf mitochodriale DNA?

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            • #7
              Ja, man wählt eben unterschiedliche Primer. Wobei es bei der mitochondrialen DNA den Vorteil gibt, dass jede Zelle bereits dutzende bis hunderte Kopien vorliegen hat.

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              • #8
                Schön, dass es ein bisschen Interesse an dem Thema gibt.
                Zitat von Sternenkreuzer Beitrag anzeigen
                Unterscheidung von Mitochondrialer DNS und ZellkernDNS.
                Man stellt es sich heute so vor, dass die Mitochondrien die reduzierten Formen einst unabhängiger Zellen darstellen. Sie verfügen über eigene Menbranen, haben eigene t-RNAs und somit die Fähigkeit zur eigenen Proteinsynthese und ein inzwischen stark reduziertes Genom, in welchem nur noch die allerwichtigsten Gene codiert sind: die für die 16S- und 12S-RNA der mitochondrieneigenen Ribosomen, 22 Gene für tRNAs und dann noch einige Gene für Proteine der Atmungskette. Der allergrößte Teil der von den Mitochondrien benötigten Gene werden allerdings im Kern codiert und deren Produkte ins Mitochondrium importiert.

                Zitat von Dannyboy Beitrag anzeigen
                Ja, man wählt eben unterschiedliche Primer. Wobei es bei der mitochondrialen DNA den Vorteil gibt, dass jede Zelle bereits dutzende bis hunderte Kopien vorliegen hat.
                Richtig. Jedes Mitochondrium enthält ein eigenes Genom und von den Mitochondrien gibt es wiederum sehr viele pro Zelle. Das erhöht natürlich die Wahrscheinlichkeit, dass bei alter DNA zumindest mitochondriale DNA noch in detektierbaren Mengen und Längen erhalten geblieben ist.
                "En trollmand! Den har en trollmand!"

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